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SpectraPlex:赋能Nature Methods 2024年度空间生物学方法的3D超多标成像工具(上篇)

同时15色3D 空间生物学共聚焦成像系统

2024年,Nature Methods 将空间生物学评选为年度方法,进一步凸显了这一领域在揭示细胞空间分布与功能关系方面的革命性进展。空间生物学通过将高分辨率成像技术与多重分子标记相结合,使研究人员能够在组织和细胞的三维空间中解析复杂的生物过程,为理解细胞相互作用、组织结构和疾病机制提供了前所未有的视角。然而,随着标记物数量的不断增加,传统的成像方法面临串扰、成像时间长及数据处理复杂等挑战,亟需更高效、精准的解决方案。

SpectraPlex 正是在这一背景下应运而生,它作为一款专为空间生物学设计的 3D 超多标成像工具箱,依托 STELLARIS 显微镜系统,提供创新的工作流程实时拆分算法,突破了多标成像的技术瓶颈。

它通过简洁的工作流程,指导面板创建、自动优化采集设置,并结合经典单标染色法与半盲参考数据,利用先进的实时拆分算法实现高效图像采集。此外,SpectraPlex 引入了创新的分组染色法,用于生成拆分参考数据。SpectraPlex 提供可靠的数据质量,确保实验结果的可重复性,并推动空间生物学新发现的实现。例如,其在 15 重免疫学标记表型分析中的应用,展示了这一工具的强大性能与数据可视化能力。

对于经典的单一染色控制法,每个标记物都有一个专用样本,提供可靠的“基准真值”来源。但这种方法耗时长,且需要大量样本。在采集每个控制样本的过程中,SpectraPlex 开始计算拆分矩阵,这一步允许用户控制初始设置和激光功率,从而优化成像参数。如有需要,未染色的对照样本图像可用于评估内源荧光的贡献,并将这些信息整合为检测通道。这些内源性成分的光谱特性会生成光谱指纹,从而考虑其对整体成像的影响。

第二种方法是 SpectraPlex 独特的创新方法,该方法基于部分染色样本的参考建议。这种方法显著减少了生成参考数据所需的生物材料量,同时也缩短了制备与成像时间。该新方法利用每个荧光团的理论光谱信息生成初始串扰矩阵。仪器设置的仿真基于这些输入,生成适用于拆分矩阵参考成像的标记物子集分组(图 3a)。拆分数据采集分为两步:第一步,根据串扰矩阵和标记物子集的光谱分布生成成像设置,并采集接近无串扰的结果;第二步,评估这些子集的有效光谱贡献(包括其相对强度)(图 3b)。随后,在完整面板设置下进行采集,实现 15 重标记样本中所有荧光团的成像。通过结合首次接近无串扰数据和完整 15 重标记数据(面板参考数据),生成最终的拆分矩阵(图 3b)。

图 3 | 使用部分染色样本获取参考数据。

a,通过结合理论光谱计算得到的串扰矩阵以及可能的硬件设置排列,生成包含标记物子集的分组(此处为三张部分染色样本),以获得接近无串扰的信号。实验室可以相应地制备这些参考样本,随后进行两步数据采集。

b,首先采集接近无串扰数据集(上排),随后进行对应的完整染色(15 通道)成像(下排),以显示完整面板中信号的相对分布。每组的两次数据采集结果相结合,并用于拆分算法,生成最终的拆分矩阵(详细信息见正文)。

第三种方法直接从使用完整面板染色的样本中生成参考拆分矩阵(图 2b)。SpectraPlex 会自动选择每个通道中含有特定荧光团贡献且在其他通道上信号最小的区域。

对于这三种方法,参考图像中的感兴趣区域(ROI)会被自动选定,用于提取光谱特征。用户可以根据需要审查、调整或修正特定通道的感兴趣区域,以确保信号的最高准确性和保真度(图 2b)。单一染色参考法和完整面板染色法是目前大多数拆分方法中常用的经典策略(单一染色参考方法的示例见文献 5,6,盲拆分方法的示例见文献 7,8)。在 SpectraPlex 中,完整面板法是一种半盲拆分方法,基于输入光谱以及系统和实验设置信息作为起点。

我们的专有分组法值得更详细的描述(图 3)。其数学描述基于一般的线性拆分框架,涉及四个向量:A、R、M 和 U。其中,A 表示采集图像通道的强度,c 为图像通道索引,C 为通道数量。R 表示拆分结果,d 为标记物索引,D 为荧光染料数量。M 为混合矩阵:

在完整的多标实验采集中,标记物的信号会发生串色。因此,M 将拆分结果 R 中各荧光染料的信号转换为采集图像 A 中每个像素 p 的检测信号,其中 P 为像素数量:

线性拆分通过拆分矩阵 U 对采集到的强度进行反向转换:

其中,U 是混合矩阵 M 的转置逆矩阵:

在此框架中,函数 t 将部分染色参考样本的通道映射到最终多标设置的通道,而函数 T 提供用于构建部分参考分组的标记物数量:

其中,s 为部分参考样本数量,l 为部分参考分组中的通道数量,d 为完整多标面板中的通道数量。

使用参考分组采集的图像强度用向量 G 表示(针对每个像素 p),而完整多标设置采集的图像强度则用向量 F 表示:

我们旨在使参考分组采集的接近无串扰图像 G 与完整多标设置采集图像 F 之间的差异平方和最小化:

对于混合矩阵中的每个通道 c,我们分别进行拟合操作。采用最小二乘拟合方法会生成一个线性方程组,从而计算出最终的拆分矩阵。SpectraPlex 利用 STELLARIS 专有的光子计数方法 Power Counting 来生成拆分矩阵。这种方法确保了直接的信号量化以及不同成分对整体面板贡献的评估,同时简化了跨实验中所有荧光团信号强度的评估和比较。

需要注意的是,当后续实验步骤中获取的通道集合保持相对强度不变时,某个特定的拆分参考采集在整个实验中仍然是有效的。然而,尽管样本的制备采用相同的流程并且标记物的用量一致(理想情况下在一个主混合液中),从对照组到样本组之间在实际操作中仍可能存在显著的变异。这种情况下,可能需要调整整体信号强度,但不能破坏各个通道之间的平衡。SpectraPlex 通过全局强度调整功能解决了这一关键问题,确保了所有通道信号的整体平衡。

综上所述,SpectraPlex 在超多标成像技术上取得了显著进展,为研究者提供了一个在 STELLARIS 系统中更加简便高效的工作流程。通过简化实验设计和数据采集过程,SpectraPlex 实现了高效且精准的多重标记检测,显著提升了成像数据的质量和可靠性。其灵活的拆分矩阵生成策略使研究人员能够根据实验需求选择更合适的方法。SpectraPlex 解决了当前多标成像技术的局限性,为未来空间生物学研究树立了新的标准。这一创新突破为深入探究组织内细胞结构与相互作用提供了新的见解,推动了我们对生物功能和疾病机制的理解。

作为一个应用实例,我们展示了一个包含 15 种免疫学标志物的面板,可用于分析小鼠淋巴结中不同细胞群体的表型(图 2c)。SpectraPlex 使高分辨率的 3D 超多标成像成为可能,成功克服了当前技术的局限性。

参考文献:(上下滑动查看更多)

[1] Schweikhard, V. et al. Nat. Methods https://www.nature.com/articles/d42473-

020-00398-0 (2020).

[2] Kunz, L. et al. Nat Methods https://www.nature.com/articles/d42473-024-

00260-7 (2024).

[3] Schulte, S. J., Fornace, M. E., Hall, J. K. & Pierce, N. A. Development https://doi.

org/10.1242/dev.202307 (2024).

[4] Stoltzfus, C. R. et al. Cell Rep. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.107523

(2020).

[5] Zhao, C. & Germain, R. N. Immunother. Cancer https://doi.org/10.1136/jitc-2023-

006923 (2023).

[6] Gorris, M. A. J. et al. J. Immunol. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1701262

(2018).

[7] Neher, R. A. et al. Biophys. J. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2008.10.068 (2009).

[8] Seo, J. et al. Nat Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-022-30168-z (2022