骨骼是支撑身体的硬组织，骨骼中无机成分（钙等）的比例仅为45%（重量），其余由水和以胶原蛋白为主的有机成分组成。在矿化骨中，主要由钙和磷酸组成的无机晶体沉积在胶原蛋白上，胶原蛋白主要是由成束的胶原蛋白分子构成。坚韧的骨头是坚硬而有柔韧性的，硬度来源于无机成分，柔韧性来源于胶原蛋白。北海道大学口腔医学研究院药理学系的Tadahiro IIMURA 和 Takanori SATO 博士正在研究一种用于治疗骨质疏松症的药物PTH（特立帕肽）制剂的药理作用。本应用笔记介绍了多光子显微镜中的SHG成像模式（二次谐波生成）和AI 技术相结合的技术路线，并以此来定量评估骨中胶原蛋白的空间排列情况。
简介
IIMURA 教授等人建立了一种评估骨形成的方法，该法通过在不染色的情况下来可视化骨骼中的胶原纤维，并测量它们的长度、面积和角度以此达到评估目的。此外，通过将PTH制剂给予骨质疏松模型食蟹猴，揭示了PTH制剂在骨胶原纤维排列上发挥一定的药理作用（见参考文献）。实验概要和结果为了了解骨骼的特征，作者通过 SHG 成像观察了正常猴子的整个骨骼切片（图1）。由于骨骼上覆盖着磷酸钙晶体，因此之前的组织观察方法通常需要脱钙过程以去除矿物质。相比之下，SHG 成像不需要脱钙，使我们能够在不染色的情况下观察胶原纤维（图 1 中显示的蓝色荧光信号）。由于观察到的骨切片相对较大（横向 1.0 cm x 纵向1.5cm ），并且表面不完全平整，因此有必要考虑其厚度变化进而来调整焦点位置以进行准确的成像。其中，将大图拼接和Z轴层扫结合起来获取图像可能是一种比较好的解决方案，但使用传统显微镜会需要很长时间。新型 AX R MP 多光子显微镜在单次拍摄条件下，其捕获区域的面积是传统型号的1.4倍。使用这种新型显微镜，可以大大减少捕获整个骨骼所需的图像数量，从而缩短采集时间。由于 Lambda D 系列物镜在整个视野范围内都有很高的平场性，因此十分有利于创建无缝拼接图像，在这种情况下，它对于观察大样本非常有用（图 1）。
图 1. 猴子未脱钙骨切片的二次谐波图像。采集条件：共振扫描（1K扫描分辨率）+ Denoise.ai，物镜：CFI Plan Apochromat Lambda D 10X（NA
0.45，WD 4.00），图像数量：1320张（图像拼接：水平方向120 个视野， Z轴层扫：11 个光学切片），激发波长：920 nm。
此外，高速共振扫描(Resonant scanner)和 Denoise.ai 的结合使我们在无平均处理的前提下，轻而易举得获得低噪声图像（图2）。简而言之，对同一样品，以前使用传统显微镜拍摄可能需要几个小时，现在我们只需要数十分钟，大大提高了拍摄效率。图2. 使用 Denoise.ai 改进图像信噪比。Denoise.ai 是一个经过预训练的 AI 软件模块，它可以自动降低共振扫描图像的散粒噪声。
IIMURA教授和 SATO 博士的论文中指出，骨切片在经 PTH 制剂处理之后，其中的胶原纤维呈线性而有规则地排列，形成长而粗的纤维结构。通过PTH制剂的给药，促进了施加于骨骼的力的释放，形成了坚韧、有弹性的骨骼。SHG成像法作为一种新的标准非常有利于抗骨质疏松药物的评估。参考文献Microscopy (Oxf). 2021 Nov
24; 70(6): 498-509. doi: 10.1093/jmicro/dfab020. A quantitative analysis of
bone lamellarity and bone collagen linearity induced by distinct dosing and
frequencies of teriparatide administration in ovariectomized rats and monkeys.Takanori Sato, Aya Takakura, Ji-Won Lee,
Kazuaki Tokunaga, Haruka Matsumori, Ryoko Takao-Kawabata, Tadahiro Iimura.
