可调光束直径和匹配的焦点位置，适用于多达四种红外（IR）波长
多光子显微镜是生命科学研究中的热门话题之一。徕卡显微系统公司推出的 STELLARIS DIVE 该装置能够同时对多达四个红外光束的光束直径和轴向红外校正进行自由调节。
1931 年，玛丽亚·戈佩特-梅耶在其博士论文中提出，通过同时吸收两个能量为激发所需能量一半的光子，可以激发一个电子系统[1] 。 当用高强度红外（IR）激光照射时，可以在物镜的焦点体积中产生高密度的红外光。为了获得二维图像，焦点必须在显微镜视野中扫描。科林·谢帕德首次描述了这种用于非线性照明的扫描显微镜[2] 。A. Diaspro 则对该领域的扫描共聚焦和多光子显微镜进行了全面综述。[3]
为什么要花钱购买复杂的扫描显微镜和昂贵的IR激光器，如果简单的荧光显微镜就能获得荧光图像？多光子激发提供了两个显著的好处：
双光子激发荧光依赖于强度的平方，只有在焦点体积内才具有足够的强度。因此，只有在此处的分子才会被激发并通过荧光发射。
生物样本是浑浊的，会导致瑞利散射，其散射强度与波长的四次方成反比。当照明波长加倍时，瑞利散射的损失减少到 1/16。
由于该方法采用点扫描显微镜，多光子激发系统通常建立在共聚焦束扫描显微镜的平台上。基本的修改是安装高强度脉冲IR激光器。
显微镜的主要目标是提供高光学分辨率的放大图像。 dA = λ/2NA。 这个公式类似于恩斯特·阿贝的理论[4][5] ，由下标 A 指出。根据方法和前提条件，理论极限是不同的，但总是与阿贝公式相差不远。（有关简要比较，请参阅作者的另一份报告[6] ）。
这个极限要求照明在物镜的后焦平面上均匀分布。这个要求意味着强度是均匀的：在每个瞳孔平面上的每一点具有相同的亮度（图 1）。
激光束的强度（横截面束宽）并不均匀。它更像是一个二维高斯分布（在最佳情况下）（图 1a）。为了确保均匀照明，激光束通常会被扩展，仅使用内部部分。此时，边缘的强度残余下降可以忽略不计（图 1，左侧行）。
图 1：激光束直径变化的影响 a) 激光束的强度分布 I，呈现高斯径向分布。通过光学改变束直径，形状保持不变，但最大强度可能增加（较小的束直径，右侧）或减少（较宽的直径，左侧）。总能量不变。b) 左侧：为了获得完整的分辨率，后焦平面 P（瞳孔）处的强度分布应为平坦。通过用宽束直径“过填充”瞳孔来实现这种均匀性。物镜 L 将光聚焦到焦平面上的样品 S。右侧：为了产生足够的双光子激发荧光，可以使用较小的束直径，以避免切割激发能量。此时，瞳孔处的强度分布不平坦，而是边缘较暗，对应于虚拟较小的数值孔径。c) 焦点体积由波长（颜色）和数值孔径决定。为了获得完整的分辨率，较宽的束产生较小的体积（左侧），对应于在 x、y 和 z 方向上的更高分辨率。能量可能较少，从而产生相应较少的荧光发射（绿色）。更窄的光束可以激发更强烈的荧光（右侧），但与更大的聚焦体积相关，因此分辨率降低。可以计算出一个特定的光束直径，以实现最佳能量和分辨率。
然而，这种对光束的操控造成了一个技术困境：为了获得最高分辨率，强度必须均匀，但为了在样品内部获得最佳的多光子激发，我们需要尽可能高的强度，不能切去激光束横截面的重要部分 [7] 。实际的解决方案是一个可变光束扩展器（VBE），允许用户根据给定实验任务决定哪个参数最重要，并相应地调整光束直径（图 1）。最佳光束直径取决于瞳孔的大小，应相应调整。
徕卡显微系统的 VBE 是一种可调光学光束扩展器，允许用户在广泛范围内调节照明光束直径，以满足分辨率和穿透深度的要求。
由于折射的波长依赖性，不同颜色的光线在通过聚光透镜时会显示出不同的焦点位置，这种现象被称为轴向色差。在可见光谱范围内（400 至 700 纳米），显微镜和相机的光学透镜通过组合具有不同折射特性的透镜来最小化这种色差。对于特殊应用，还提供了校正到近紫外和近红外范围的透镜。
然而，常见透镜并未针对同时使用多个红外波长进行校正。在这里，我们可以利用激光束的单一颜色，通过可变光学元件来校正激发焦点。通过引入发散偏差，焦点可以连续移动并适应任何红外颜色。这一结果是通过可变光束扩展器的设计实现的，它提供了两个自由度，可以独立调节光束直径和焦点位置。
图 2：通过修改光束特性来校正纵向色差。左：当两束同轴且平行的激光束（两种IR波长分别用浅红色和深红色表示）正确照射一个次级校正透镜时，焦点体积可能不重合。这个色差在下方的深绿色和黄色发射中得以体现，显示了焦点区域的放大草图。右：通过改变激光束的发散度，深绿色的焦点体积可以沿轴向移动，直到与黄色体积重叠，形成明亮的绿色荧光，显示出完全重合。这个操作由小箭头指示。
通过这种方法，可以确保不同红外波长的光束聚焦在同一位置，这对于多色红外激发至关重要，以确保所有图像在 z 方向上对齐。
VBE 提供多达四种不同红外照明波长的光束整形，所有红外光束都可以独立调节分辨率和穿透深度，并进行焦点校正，确保不同红外颜色激发的完美重合。
[1] Göppert-Mayer M (1931) Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Göttinger Dissertationen. Annalen der Physik 401/3: 273–294
[2] Sheppard CJR and Kompfner R (1978) Resonant scanning optical microscope. Applied Optics 17/18 pp 2879-2882
[3] Diaspro A (Ed) (2002) Confocal and Two-Photon Microscopy. Wiley-Liss, New York
[4] Abbe EK (1873) Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für Mikroskopische Anatomie 9(1):413–468.
[5] Wilson M: Microscope Resolution: Concepts, Factors and Calculation (2016)
[6] Borlinghaus RT (2017) The White Confocal – Microscopic Optical Sectioning in all Colors. Springer International Publishing. Cham, Switzerland.
[7] Helmchen F and Denk W: Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods 2/12 (2005) 932-940
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