近日，湛江中心人民医院张超博士、冯伟博士和合作者发展了一种基于完整颅骨的长期稳定光透明颅窗技术，可长时程、高分辨地监测活体小鼠皮层与颅骨骨髓血管成像，并追踪了发生缺血性损伤后其微血管的损伤与再生过程。该光透明颅窗技术可为活体成像如双光子实验研究脑部结构提供重要支持，此研究在Advanced Science期刊发表。
研究背景
光学成像技术由于其高的时空分辨率而被广泛使用在活体动物实验中，如光学相干断层扫描（optical coherence tomography，OCT）、光声成像（photoacoustic imaging）和多光子激光扫描显微镜成像 （multiphoton laser scanning microscopy imaging）有助于研究细胞和血管的结构和功能动力学。然而因颅骨具有高散射特性，成像分辨率受限。当前针对大脑皮层的成像研究一般使用磨薄颅窗和开颅玻璃窗，这些基于精细手术的颅窗模式对探究脑结构发挥了重要作用。但仍然有一定的限制，比如手术过程破坏了颅骨的完整性，可能会引起免疫反应，造成对脑相关病理生理过程的错误解读。近年来，随着活体颅骨光透明技术的快速发展，各种颅骨光学透明剂的应用，可实现完整颅骨的透明化，但其透明效果是暂时的。每次成像前均需对颅骨进行透明化处理，耗时、复杂，不适用于清醒动物成像研究。 为了克服现存颅窗技术的限制，研究人员发展了一个新的方法，命名为长期光透明颅窗技术（long-term clearing cranial window，LCCW）。LCCW 的建立包括四个步骤： 1）把小鼠稳定在定制化的装置中，去除头皮、清理粘膜（图1A）。 2）将清除液S1 加入颅骨，用棉签轻轻擦拭，加快其清除速度。约 15 分钟之后，将溶液S2 应用于颅骨，待颅骨透明。 3）为了维持颅骨长期的透明度，添加颅骨透明维护试剂，其由涂底凝胶、粘连凝胶和密封胶组成。在头骨上涂抹了一点涂底凝胶，然后滴一滴粘连凝胶混合均匀。接使用一个LED灯在距离 30 cm 处照射（间歇&连续照射）约 4 分钟至完全凝固。 4）涂上一层密封胶，使用相同的LED进行周期性或连续性照射共2分钟。
另外，研究人员测量了固体颅骨透明维护试剂在 300~1500 nm波段内的透光率（图1B）。结果表明，该试剂在400~1500 nm 波段内有高的光透过率，特别是在400~ 1100 nm 和 1200~ 1300 nm波段，几乎达到100%。同时，对大脑和颅骨血管在不同的条件下进行直接观察（图1C）。结果表明，在初始状态，皮质血管和颅骨血管均不可见。仅使用颅骨光学透明液可以观察到血管。进一步，通过应用颅骨透明维护试剂，清颅状态可得到极佳的保存，允许我们长期监测大脑和颅骨血管。
图 1. LCCW 的建立。 A) LCCW 建立过程的示意图。B) 固体颅骨清除维护试剂的透射率与空白盖玻片相当。C) 干颅骨(Initial)、光透明颅窗 (Clearing) 和LCCW的代表性照片（八周龄大的小鼠）。D) OCT 横截面图像。 同时，研究人员调查了LCCW 用于双光子显微成像的成像性能。 相同的成像参数下，LCCW有效提高了成像深度和荧光信号强度（图 2A,B）。 这使我们能够清楚地区分树突棘和神经元胞体（图 2C） 。 此外，作者使用200 nm 荧光小球分别探索了在水和固体颅骨清除试剂下，由于介质的折射率不匹配可能引起的显微成像像差。 结果发现，固体颅骨清除维护试剂对图像横向和轴向分辨率的影响最小。 由此，LCCW可以使用在荧光显微成像中，增强成像性能。
图2. LCCW 建窗前后皮层神经元的双光子成像。A）10周龄 thy1-YFP小鼠在LCCW颅窗创建前后的神经元3D 展示。B) 神经元荧光信号强度在轴向深度方向的分布。C) 突触成像和神经元胞体的双光子代表性图像（箭头指向树突棘）。
为了说明LCCW 方法对长期成像的稳定性，研究人员监测了成年小鼠的大脑皮层和颅骨血管连续8周的变化。图3A是使用 OCT 拍摄每周血管的MIP图谱。随后对血管的结构的变化进行了定量分析，显示不同时间点下皮层和颅骨血管的密度和分支数量比较稳定。图像信噪比和对比度几乎没变化，暗示着LCCW可以维持长时程成像的卓越性能。另外， 研究人员对LCCW 的建立可能引起皮层和颅骨的炎症反应进行调查。使用尼康A1MP 观察Cx3cr1EGFP/+ 小鼠的皮层中小胶质细胞和颅骨骨髓腔内中单核细胞的一小时内迁移情况（图3C），发现除了偶尔的脚摆动，小胶质细胞在皮层几乎没有迁移。而且颅骨髓腔内的单核细胞，大多数几乎没有随着时间迁移。综上所述，稳定性皮质/颅骨血管和小胶质细胞/单核细胞显示LCCW几乎不影响皮质和颅脑微环境，因此，它可以成为活体成像的安全工具。
图3. LCCW建窗对皮层和颅骨的长期成像性能评估 。(A)大脑皮层与颅骨骨髓血管长期监测的代表性图片；(B)纵行监测不同时间点血管的密度、分支和图像的对比度及信噪比变化；(C)双光子A1MP显微镜对建窗后皮层中小胶质细胞与颅骨中骨髓单核细胞的迁移成像。
该长期透明颅窗 显着提高了光学成像分辨率和深度，监测清醒小鼠缺血性损伤后皮质和颅骨血管损伤和再生过程，发现颅骨血管比皮质更早恢复。转录组分析表明，缺血性损伤后，基因表达模式和免疫细胞丰度在脑和颅骨之间存在显着差异，这可能是他们之间血管恢复的时间滞后的原因之一。这些发现对血管再生和重建有很大启示。此外，LCCW 提供了一个用于大脑和颅骨骨髓成像的最低限度侵入性方法。
产品信息
尼康公司多光子显微系统进行了全方位升级，新发布产品型号为 AX R MP ，其可高速、高分辨率获取活体深部的大视场图像。主要特征： 1. 在视场数22mm的宽场下获取高速、高分辨率2K×2K图像（2048×2048像素）。利用共振扫描仪，可高清捕获视场周边高速变化的活体反应。 2. 物镜下方空间广阔，满足各种不同的实验需求。 物镜可旋转，实现各角度观察。 MP专属物镜可大视场观测活体深部。可高效获取更多信息，精细捕捉生命现象。
ChaoZhang, Chun-Jie Liu, and Wei Feng. A Long-Term Clearing Cranial Window for Longitudinal Imaging of Cortical and Calvarial Ischemic Injury through the Intact Skull. Adv.Sci. 2022 , 2105893.
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