树突棘是高度动态的，它们的形状和/或数量的变化有可能主导认知过程和神经精神疾病的突触可塑性。最新证据显示，被称为树突小刺的树突棘上细长的瞬时刺状突起可以介导突触的可塑性，以响应突触活动的变化。数十年前，树突小刺在电镜下首次被观察到，它们的长度通常小于1微米，比丝状伪足更细，最常存在于大的蘑菇状树突棘上（Petralia et al., 2015）。它们纳米级的结构超过了传统共聚焦的分辨极限。因此，大多数关于树突小刺的研究都是通过固定脑片的电镜成像来进行的，缺点是只能获取单张图像而没有时间分辨率。为了更好地理解活体树突小刺调控机制和功能，有赖于对其开展时间序列成像，此前相关研究的活体高速三维成像必须依赖超分辨率荧光显微镜。在这篇应用笔记中，我们使用了强荧光进行神经元的标记，优化了尼康共聚焦的成像参数，并使用NIS-Elements
3D反卷积做了图像后处理（Zaccard, et al., 2021）。这一技术成功实现了对树突小刺的精细观察和动态示踪，包括突触前和突触后标志物相关的单个树突小刺，揭示了突触小刺不同亚型在动力学、长度、寿命以及调控和功能上的差异（Zaccard,
et al., 2020）。共振扫描观察活体树突小刺的时间序列成像
已有的电镜研究表明，一些树突小刺形成于复杂的突触后致密区（PSD），而另一些则形成于PSD边缘或树突棘颈部（Zaccard et
al., 2020）。为了研究PSD相关的树突小刺起源，我们化学转染了小鼠皮质神经元，在细胞中表达mRuby，用GFP标记内源性PSD95蛋白（Gross
et al., 2013）。对树突小刺和PSD结构以8秒/次的速度进行高分辨率Z轴序列成像（Figure
1，top）。结果显示，蘑菇状树突棘形成的树突小刺多数是瞬态的，仅维持数秒，往往起源于简单PSD的边缘。有趣的是，我们观察到一个长寿命、细长的树突小刺亚型，它和复杂PSD有关且可以运输PSD片段（Figure1，bottom）。树突小刺亚型受局部钙离子瞬时浓度的调控，而突触后Rac1-GEF
kalirin-7调控其形成、延伸和在相同树突棘头部位置的重现（数据未展示）。
图1. PSD相关的短寿命和长寿命活体树突小刺的时间序列高分辨率共聚焦成像。绿色：GFP标记的PSD95蛋白；红色：mRuby标记的神经元；物镜：Plan Apo Lambda 100X，共振扫描，4X平均；每个Z轴序列43层，间隔约8秒扫描一次，总时长600秒。白色箭头：长寿命树突小刺；黄色箭头：短寿命树突小刺；星号：PSD片段。检流计高分辨率扫描观察突触前后的共定位情况接下来，我们分别对稳态条件下和被激活后的小鼠皮层神经元进行了高分辨率共聚焦成像，以研究树突小刺与树突棘头部近端和远端的突触前末稍的共定位。树突小刺按照长度进行分组，分别统计稳态下和激活状态下树突小刺与近端和远端突触前末梢的接触点数量。GFP转染的神经元进行固定或经NMDAR激活30min后固定处理，免疫标记突触前bassoon和F-actin(phalloidin标记) 轴突结构。使用检流计扫描和线平均（Line average）进行成像，并通过3D 去卷积可视化突触前末端和phalloidin标记的轴突。结果显示，大部分短的树突小刺（＜1μm）都是瞬时的，并不接触突触前末端。激活可以增加树突小刺的数量、长度以及长树突小刺接触树突棘头部远端突触前末梢的频率。长的丝状伪足样的树突小刺可延伸至与多个远端突触前终端接触（图2，左），而蘑菇状的树突小刺一般只接触单个突触前终端（图2，右）。此外，突触前和突触后标志物都存在和长寿命蘑菇状树突小刺尖端的共定位（数据未显示），提示二级突触的形成。
图2. 固定细胞的分辨率增强共聚焦成像显示延伸的树突小刺和远端突触前末梢的共定位。
绿色：GFP标记的神经元，红色：Bassoon标记的突触前末端；蓝色：AF647标记的F-actin 。物镜：Plan Apo Lambda 100X，检流计扫描，2-4X平均，Z轴层数：左46，右34。箭头：突触前末梢与树突小刺的共定位。
1. Gross, G.G. et al., Recombinant probes for visualizing endogenous synaptic proteins in living neurons. Neuron,2013 Jun 19;78(6):971-85.
2. Petralia, R. S. et al, Structure, Distribution, and Function of Neuronal/Synaptic Spinules and Related Invaginating Projections. NeuromolecularMed. 2015 Sep;17(3):211-40.
3. Zaccard, C. R. et al., Rapid 3D Enhanced Resolution Microscopy Reveals Diversity in DendriticSpinule Dynamics, Regulation, and Function. Neuron. 2020 Aug5; 107(3):522-537.e6.
4.Zaccard, C. R. et al., Protocol for live enhanced resolution confocal imaging of dendritic spinule dynamics in primary mouse cortical neuron culture. STAR Protoc.2021 Apr5; 2(2):100427.
产品信息：
AX/AX R 共聚焦显微镜
这款共聚焦显微镜可以获得高达8K X 8K 的图像分辨率，是传统机型的四倍。对角线25mm的大视野FOV可以允许您在一次扫描后就获取大面积样本的图像，降低了对标本的光毒性。AX R的共振扫描头可获取2K X 2K像素的高分辨率图像，并允许以高达720fps（2048X16像素）的高速采集速度进行活样本的动态采集观察。
