表型筛选是一种基于细胞的、自动化的、高通量的检测,用于识别引起模式细胞形态变化的化合物、肽和siRNA。通过从对照细胞和药物处理过的细胞的显微镜图像中量化细胞形状、细胞死亡、细胞器和用荧光探针标记的蛋白质的变化,可以鉴定和验证新药物。
你是否有过这样的经历:即使你能观察到药物处理过的细胞的形态学变化,但定量测量结果显示与对照组细胞相似,而无法用数字说明药物作用导致的形态学变化的差异?你是否曾在选择细胞形态学参数和分析方法上遇到困难?
为了分析由药物作用引起的表型差异,有必要考虑对照组细胞的差异性和细胞的特性。本应用说明介绍了一个例子,其中使用NIS-Elements成像软件的General Analysis 3(GA3)可选图像分析模块识别细胞区域,并使用多种形态参数分析三种具有不同形态的细胞类型,以及如何为每种细胞形态选择最佳分析方法。

在明场图像中创建细胞Mask(掩膜)

Homogeneous
Area Detection

Fig.1: Brightfield
images overlaid with cell masks (pink) and nucleus masks (yellow)

Objective: 20X, Scale bar: 100 μm.

General Analysis 3 图像分析中的Homogeneous Area Detection模块具有检测明场图像的背景均质区域的功能。使用这个功能,明视野图像的背景区域被二进制化和反转,以创建细胞区域的Mask 。荧光通道图像中的DAPI染色的细胞核区域被二进制化以创建一个细胞核Mask 2>,并使用Watershed功能进行划分3>,然后对单个细胞进行划分4>。这样就能创建细胞Mask和细胞核Mask 5>。这可以有效地利用荧光波长来分析细胞器和特定的蛋白质,而不必为只识别细胞区域而进行绿色或红色荧光染色。

 

材料和方法
将固定在96孔板上培养的HeLa细胞、HepG2细胞和角质形成细胞(keratinocytes),用DAPI进行细胞核染色。使用Ti2-E倒置显微镜、DS-Qi2单色相机、D-LEDI荧光光源和新品 Lambda D 20x 物镜采集明场和DAPI图像,并使用NIS-Elements的General Analysis 3 创建细胞形态分析工作流。在Batch
GA3上进行图像分析,并在Microsoft Excel®中创建图表。
实验结果

细胞形态的特点和图像分析方法的选择

HeLa细胞:有平坦的片状伪足,其单个细胞面积有很大的差异性。伪足区域的对比度很低,所以很难高度准确地检测到细胞周围区域。HeLa细胞的细胞面积在细胞密度高的区域很小,在细胞密度低的区域很大。因此,当药物效果评价的终点时,对照组细胞的汇合度很高,用细胞面积作为参数很难明确对照组细胞和药物处理细胞的表型差异。如果用细胞面积作为HeLa细胞药效试验的参数,有必要在细胞密度相对较低的条件下评价药效。
HepG2细胞:细胞核/细胞质面积比很高,细胞容易聚集,所以细胞核分析很困难。细胞之间的界限不清楚,但是背景区域和细胞区域之间的分界线是清楚的,所以定量分析视野中的总细胞面积是容易的。

Keratinocyte细胞:细胞核中心与细胞中心之间的距离很短,细胞和细胞核的面积略大。细胞核的圆度很高,细胞形态的变异性很低。由于相邻细胞的细胞核之间的距离很长,所以细胞核的形态学分析很容易。下图展示了各种细胞的形态。

总结

  1. 1)使用Homogeneous Area
    Detection
    功能,可以从明场图像中生成胞Masks,并进行细胞形态学分析;

2)通过评估对照组细胞的差异性,可以选择最佳分析参数。上表展示了各种细胞图像分析容易程度的比较。

产品信息
General Analysis 3
General Analysis 3NIS-Elements成像软件的可选图像分析模块。通过该分析模块,细胞区域可以很容易地被二值化和测量。并可以根据您的目的进行灵活的图像分析。

CFI Plan Apochromat Lambda D 20x
该物镜可以获得25毫米大视野的图像,且视野边缘亮度均匀、清晰锐利,因此在定量分析中可以获得高度可靠的结果。

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