活体脑成像研究对于揭示生理、病理条件下脑血管与细胞结构和功能的变化规律而言至关重要。然而小鼠头皮和颅骨组织对光的高散射特性严重限制了光学成像的分辨率与组织成像深度。因此，研究人员需借助合适的“颅窗”实施脑的高分辨成像研究。
去年张超博士与冯伟博士提出了长期稳定透明颅窗技术，单次透明化处理即可实现长达两个月的皮层或颅骨的高分辨成像追踪[1]。但其手术操作过程中仍需要去除头皮和颅骨骨膜，不利于颅骨骨髓微环境的长期研究。此外，目前组织光透明成像过程中均未考虑透明化试剂与物镜以及透明组织本身的不均一所引起的像差问题，进一步限制了组织光透明方法的成像能力。为了克服以上问题，该研究团队发展了一种全新的组织光透明成像技术，结合自适应光学成像技术实现了穿皮/穿颅的皮层高分辨成像与操控[2]。
如图1所示，通过定量地比较分析多种试剂的透明化能力和光透过率，筛选出最优的适用于近红外成像窗口的头皮光透明剂。该脑成像窗的建立方式也极易掌握，主要包括脱毛、去角质、滴加透明试剂实施成像等步骤，随后用生理盐水复性并涂抹凡士林保湿即可。
图1. 成像窗建立的流程图。
图2. 无波前传感器自适应光学。(a)装有可变形透镜以校正像差的双光子成像示意图。(b)无传感器AO校正算法流程图。
如图3 (a)所示，自适应光学（AO）可以极大地提高双光子成像性能，荧光小球的信号强度和像差均得到了极大的改善。此外，AO也可有效增强皮层微血管和小胶质细胞的双光子成像性能（图4 (b)）。
图3. AO提高双光子成像性能。(a) 成像1 um荧光小球。(b)成像皮层血管和小胶质细胞。
此外，其进一步评估了该成像窗对双光子活体皮层成像效果的提升，并监测了大脑微血管、小胶质细胞和颅骨骨髓单核细胞的动态变化。结果显示该方法极大地提高了双光子成像的成像深度和信号强度(图4 (a)和(b))，还可高分辨成像颅骨骨髓微环境，如图4 (d)所示。图4 (c)显示皮层小胶质细胞的形态和位置几乎保持不变，表明该透明方法不会对皮层微环境产生影响。而位于颅骨骨髓血管中的单核细胞则随着血液的快速流动而移动（图4 (e)中白色圆圈所示）。综上所述，本研究基于该透明成像窗和自适应光学技术，首次利用双光子成像技术实现了穿皮/穿颅的非侵入式皮层或颅骨骨髓微环境的活体高分辨成像。
图5. 基于该颅窗和AO双光子实施激光损伤刺激后皮层小胶质细胞的变化。(a)激光损伤示意图。(b) 3.5周龄Cx3cr1EGFP/+小鼠激光损伤后皮层小胶质细胞的动态变化。
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