

本文介绍了使用超薄切片超薄切片机自动修整修块功能,获取树脂块面中带有荧光信号的细胞结构。
我们展示了如何使用配置有体视显微镜 M205 FA 的超薄切片超薄切片机 UC Enuity ,来识别感兴趣的荧光细胞,如何自动修整包含细胞的块面,以及如何在切片中观察细胞而无需转移到外部显微镜。
在修整过程中直接使用荧光体视显微镜,可避免样品丢失的风险,以及不必要的样品转移和重新调整时间。软件工作流程有助于指导整个设置过程,而修整过程的完全自动化则为用户节省了更多宝贵时间。
透射电子显微镜和扫描电子显微镜(TEM 和 SEM)等电子显微镜被广泛用于深入了解生物样本或材料的高分辨率结构。
超薄切片技术是获得小于 100 nm的薄片,以便在 TEM/SEM 中进行表征的最常用方法。在室温下制备样品时,先将小块样品嵌入环氧树脂或丙烯酸树脂中,然后通过修整去除多余的树脂,再用玻璃刀或钻石刀将样品切成超薄切片(50 nm-100 nm)。
修整过程是一个重要步骤,可去除过多的无样品树脂,暴露标本,并获得包含感兴趣区域或细胞的块面,以便进行后续切片。
在当前的标准工作流程中,使用配备的标准体视显微镜的设备,并不能在超薄切片机上直接识别实际的目标区域。取而代之的是,对切片进行染色,并将其转移到放大倍率更高的外部宽场显微镜上,以检查是否已到达标本的目标平面。之后还必须对超薄切片机进行繁琐的调整,以确保切片时不会丢失样品。
为了避免这些费时费力的转移和重新调整,最好能在超薄切片机上直接识别目标区域。荧光标记是一种标记目标区域的方法,并使用丙烯酸聚合物保留树脂内荧光,可用于 制备EM 样品。
为了填补这一空白,需要一种在修整和切片过程中提供在细胞分辨率上荧光观察的超薄切片机。配备了用于荧光成像的 M205 FA 的徕卡自动超薄切片机 UC Enuity 正好提供了这一解决方案。
在这里,我们将展示如何使用 UC Enuity 来识别感兴趣的荧光细胞,如何自动修整包含感兴趣细胞的块面,以及如何在不转移到外部显微镜的情况下在切片中观察感兴趣的细胞。
室温样品制备首先要将样品嵌入树脂中。荧光标记是标记目标区域的一种方法。
制备带有荧光信号的细胞有多个步骤,包括细胞培养、固定、高压冷冻、脱水和嵌入丙烯酸树脂。
典型的丙烯酸树脂如 LR White(室温浸润和加热聚合)或 Lowicryl TM HM20(用于冷冻置换和在紫外线下聚合),其具体使用方法查阅相关说明文件。
使用丙烯酸树脂的好处是可以充分保留超微结构,同时具有良好的抗原性和/或荧光能力。
超薄切片机配备有体视显微镜,可放大感兴趣的区域,同时保持三维感觉,以便在修整和切片时精确处理样品和刀具之间的关系。根据物镜和目镜的不同,放大倍数从 6.7 倍到 77 倍不等。
由于许多哺乳动物培养细胞在基底上的直径约为 10 微米,因此光学系统的分辨率至少应为 5 微米,才能分辨出单个细胞(遵循奈奎斯特频率)。如果细胞相互连接,不能很好地分离,因此这一点就尤为重要。
徕卡 UC Enuity 可配备用于非荧光应用的体视显微镜 M80 或用于荧光应用的 M205 FA。”80 “或 “205 “分别代表 8 或 20.5 的变焦范围。
因此,用于荧光应用的 M205 FA 型体视显微镜使用标准的 0.63x 镜头,可提供 7.8x 至 160x 的无级放大倍率,工作距离为 9.7 厘米。同时,从 25 微米到 3 微米不等的分辨率能够分辨明场和荧光中的单个细胞,甚至还能分辨亚细胞模式,如线粒体染色模式(图 1)。

根据目标分子上所附荧光团的数量,信号强度会有很大的不同。如果在标准宽场显微镜中无法观察到样品,那么在物镜开口角度有限的体视显微镜中也无法观察到样品。尤其是在超薄切片机上,为了不接触或损坏刀具或样品,工作距离必须达到几厘米。这就需要在放大倍率、开口角度(数值孔径)、工作距离和集光效率之间取得良好的平衡。在配备 M205 FA 的 UC Enuity 上,0.63x 物镜的工作距离接近 10 厘米。
如果肉眼难以观察到信号,可以通过将数码相机的曝光时间延长到 ½ 秒或更长的时间来观察微弱的信号。不过,荧光强度是否足以在超薄切片机上可视化并用于(自动)修整,这在很大程度上取决于样品。
在下文中,我们将展示使用配备 M205 FA 的自动超薄切片机 UC Enuity 的示例工作流程,包括荧光靶细胞的可视化和选择,以及包含荧光靶细胞的切片。目的是观察完整的细胞,即直接进行膜染色,并保持操作简单。为保持特定的细胞内荧光结构,应使用上述方案,包括高压冷冻和冷冻置换。

为了在刀和样品之间留出光隙以便对准,并在切片过程中获得水槽上的水面反射图像,M205 FA 立 体显微镜的安装角度为 20°。因此,无法从正面观察样品表面。
为了获得正面视图,可以使用一种灵活的镜子,即 Mesacut 镜(mesa = 台山)(图 3)。镜子的角度是灵活的,用户可以根据自己的需要进行调整。

要将样品自动修整到所需的块面,必须定义六个不同的参数(图 4)。UC Enuity 的软件工作流程可指导用户设置参数。
首先,需要输入修边刀的宽度,以确保修边刀覆盖最终的砌块面尺寸。其次,必须设置修块刀的倾斜角度。在这一步中,UC Enuity 会自动计算使用 45° 倾斜角刀具时的 X 方向刀位。第三,需要设定所需的块面宽度和高度。其次,必须设置修边深度,以确定最初应修整掉多少树脂,直至达到最终的块面。最后,必须设置最终块面的侧面修整深度。图 5 显示了软件引导用户通过自动修整工作流程定义输入值的一个示例截图。





由于在细胞生长在蓝宝石上,细胞位于块面表面的正下方,因此无需去除正面的材料。
附注:为了接近树脂深处的目标平面,可以使用共聚焦显微镜或微型计算机断层显微镜(µ-CT)创建的样品三维数据。UC Enuity 提供了一个软件流程,可直接加载样品的三维渲染图,用于靶面修整。注:可使用此技术修整目标平面,而无需修整过程
在自动修边过程中,无需用户交互,即可创建最终的块面。自动过程包括根据定义的位置定位刀具和树脂块、切割定义的修边深度以及旋转树脂块。这样,用户就可以腾出宝贵的时间从事其他活动。

在自动切块修整后,我们对块面进行了切片,以证明配备 M205 FA 的 UC Enuity 可以在切片中看到荧光靶细胞。经过切片后,在第一个完整切片中已经可以看到细胞(图 10)。

作者要特别感谢 Felix Gaedke 博士(德国科隆 CECAD)以多种方式提供样本和知识;感谢科隆 CECAD/CMMC 成像设施负责人 Astrid Schauss 博士为作者深入了解电镜工作流程提供支持。
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